با توجه به درخواست مکرر پژوهشگران عزیز حوزه زیست شناسی سلولی، خدمات انجام تست انکسین PI با استفاده از دستگاه فلوسایتومتری جهت بررسی آپوپتوز سلولی در آزمایشگاه چکاپ به پژوهشگران ارائه میشود. این خدمات به صورت مستقیم زیر نظر دکتر پرویز فلاح، دکترای هماتولوژی و مدرس و پژوهشگر حوزه سلول های بنیادی و هماتولوژی انجام میشود.
تست انکسین PI چیست ؟
آزمایش Annexin V و PI (پروپیدیوم یدید) (annexin v/pi test)یک روش رایج برای ارزیابی مرگ سلولی و زنده بودن سلول‌ها با استفاده از تکنیک فلوسایتومتری در آزمایشگاه است.
- Annexin V: Annexin V یک پروتئین است که به فسفاتیدیل سرین (Phosphatidylserine) می‌چسبد. در سلول‌های سالم، فسفاتیدیل سرین در داخل غشای سلولی قرار دارد. اما در طی مرگ سلولی، به ویژه در مرگ سلولی به شکل آپوپتوز (برنامه‌ریزی شده)، این مولکول به سطح خارجی غشا منتقل میشود. Annexin V که با یک رنگ فلورسنت مارک شده است، به این فسفاتیدیل سرین‌های موجود در سطح خارجی غشا می‌چسبد و این امکان را فراهم می‌کند که سلول‌هایی که در حال آپوپتوز هستند، شناسایی شوند.
- پروپیدیوم یدید (PI): PI یک ماده رنگی است که به DNA می‌چسبد و فقط زمانی می‌تواند وارد سلول شود که غشای سلولی آسیب دیده باشد. این ویژگی باعث میشود PI برای شناسایی سلول‌های نکروز (مرگ سلولی ناشی از آسیب) مفید باشد. در سلول‌های سالم یا آن‌هایی که در حال آپوپتوز هستند (که هنوز غشای سلولی سالمی دارند)، PI وارد نمی‌شود و بنابراین DNA آن‌ها رنگی نمی‌شود.
در ترکیب، این دو مارکر می‌توانند تفکیک کنند که کدام سلول‌ها سالم هستند (بدون Annexin V و PI)، کدام‌ها در حال آپوپتوز هستند (مثبت برای Annexin V و منفی برای PI) و کدام‌ها نکروز شده‌اند (مثبت برای هر دو). این اطلاعات به پژوهشگران کمک می‌کند تا درک بهتری از وضعیت سلولی در مطالعات بیولوژیکی و پزشکی داشته باشند.
در چه مواردی نمیتوانیم از رنگ PI استفاده کنیم ؟
در مواردی که مارکرهای ما با PI تداخل فلوئورسنتی داشته باشند بایستی به جای PI از رنگ جایگزین استفاده کنیم. تداخل فلورسنتی بین رنگ پروپیدیوم یدید (PI) و دیگر مارکرهای فلورسنتی می‌تواند زمانی رخ دهد که طول موج‌های انتشار یا جذب این مارکرها نزدیک به هم باشند. این تداخل ممکن است باعث شود که تشخیص مرگ سلولی یا ویژگی‌های دیگر سلول‌ها که با این مارکرها نشان داده می‌شوند، دشوار یا نادرست باشد.
- مارکرهای فلورسنتی که با PI تداخل دارند:
- مارکرهایی با طول موج انتشار نزدیک به PI، مانند برخی از رنگ‌های فلورسنتی مرتبط با قرمز یا نارنجی، ممکن است با PI تداخل ایجاد کنند.
- به عنوان مثال، فلوروفورهایی مانند Texas Red یا mCherry که در ناحیه قرمز طیف نور فلورسنتی قرار دارند، ممکن است با PI تداخل داشته باشند.
- سلول‌های ترانسفکت شده با وکتورهای حاوی مارکرهای فلورسنتی:
- در مورد سلول‌های ترانسفکت شده با وکتورهایی که ژن‌هایی برای بیان پروتئین‌های فلورسنتی مانند GFP (فلورسنت سبز) یا RFP (فلورسنت قرمز) دارند، استفاده از PI ممکن است باعث تداخل در تشخیص شود.
- جایگزین‌های PI:
- برای مواردی که استفاده از PI باعث تداخل میشود، می‌توان از رنگ‌های دیگری که با مارکرهای فلورسنتی مورد استفاده تداخل ندارند، استفاده کرد.
- یکی از جایگزین‌های رایج PI، رنگ 7-AAD (7-aminoactinomycin D) است که همانند PI، به DNA می‌چسبد اما با طول موج انتشار متفاوت، که این امر احتمال تداخل را کاهش می‌دهد.
بنابراین، هنگام انجام آزمایش‌های سیتومتری جریان با سلول‌های ترانسفکت شده حاوی مارکرهای فلورسنتی، انتخاب رنگ مناسب برای تشخیص مرگ سلولی باید با در نظر گرفتن طیف انتشار فلورسنتی مارکرهای مورد استفاده انجام شود تا از تداخل‌های احتمالی جلوگیری شود.
برای انجام این تست به چه موادی نیاز داریم ؟
برای انجام تست Annexin V و PI (پروپیدیوم یدید)، که برای تعیین وضعیت مرگ سلولی استفاده میشود، شما به چندین ماده و تجهیزات اصلی نیاز دارید. لیست زیر مواد لازم را فهرست می‌کند:
- Annexin V Conjugate: Annexin V معمولاً با یک فلوروکروم مانند FITC (فلورسئین ایزوتیوسیانات) مزدوج میشود. این ماده به فسفاتیدیل سرین متصل شده به سطح خارجی غشاهای سلولی در سلول‌های آپوپتوتیک می‌چسبد.
- رنگ پروپیدیوم یدید (PI): PI یک نوکلئیک اسید که فقط وارد سلول‌هایی با غشاهای آسیب دیده میشود و برای شناسایی سلول‌های مرده یا نکروتیک استفاده میشود.
- بافر بایندینگ: این بافر معمولاً حاوی CaCl2 است، زیرا Annexin V به کلسیم برای اتصال به فسفاتیدیل سرین نیاز دارد.
- سانتریفیوژ: برای جدا کردن سلول‌ها و شستشوی آن‌ها قبل از انجام تست.
- سیتومتر جریان (Flow Cytometer): دستگاهی که برای تجزیه و تحلیل سلول‌های رنگی شده با Annexin V و PI استفاده میشود.
- لوله‌های سیتومتری یا پلیت‌های چند چاهی: برای نگهداری نمونه‌ها در طول آماده‌سازی و تجزیه و تحلیل.
- نمونه سلولی: سلول‌هایی که قصد دارید وضعیت مرگ سلولی آن‌ها را بررسی کنید.
- سرم یا بافر شستشو: برای شستشوی سلول‌ها قبل از اضافه کردن مواد رنگی.
این موارد اساسی‌ترین نیازمندی‌ها برای انجام تست Annexin V و PI هستند. با این حال، بسته به پروتکل خاص آزمایشگاهی و نوع نمونه‌هایی که مورد بررسی قرار می‌گیرند، ممکن است نیاز به تجهیزات اضافی یا گام‌های آماده‌سازی خاصی باشد.
فرایند انجام تست در آزمایشگاه چکاپ چگونه است ؟
برای انجام تست انکسین PI و یا هر نوع خدمات تحقیقاتی دیگر در حوزه فلوسایتومتری در آزمایشگاه چکاپ، لطفا درخواست خود را از طریق فرم زیر ثبت نمایید. همکاران ما با شما تماس گرفته و هماهنگی های لازم و شرایط انجام تست را به شما اعلام خواهند نمود.
